Strand特定的tophat /袖扣

Question

我有一个链特异性RNA-seq文库来组装（Illumina）。我想使用TopHat / Cufflinks。从TopHat的手册中可以看出，

“ - 库类型TopHat会将读取视为特定链。每个读取对齐都将具有XS属性标记。请考虑在下面提供库类型选项以选择正确的RNA-seq协议。”

这是否意味着TopHat仅支持特定于链的协议？我使用选项“--library-type fr-unstranded”来运行，是否意味着它以特定于链的方式运行？我用Google搜索并询问了开发人员，但没有得到答案......

我得到了一些结果：

此处重叠群由两组读数组装，左侧为反向读数，右侧为正向。 （为了可视化，我反向补充了正确的配偶）

但是一些重叠群纯粹来自反向或正向读数。如果它是链特异性的，则一个基因应该以相同的方向产生读数。它不应该像上面的图像一样报告结果，对吗？或者是否有可能一个基因被片段化然后独立排序，因此，左侧部分产生反向读取而右侧部分产生正向读数？根据我的理解，链特异性通过3'/ 5'连接保持，因此应该以基因为单位。

这是什么问题？或者我是否错误地理解了“特定链”的概念？任何帮助表示赞赏。

Answer 1

Tophat / Cufflinks不用于组装，它们用于与已组装的基因组或转录组对齐。你在读什么？ 此外，如果您有特定于链的数据，则不应选择非链式库类型。您应该根据您的图书馆准备方法选择合适的一个。如果选择非锁定库类型，则XS标记将仅放置在拆分读取上。

Answer 2

如果你想对你的转录组进行 de novo 汇编，你应该看一下汇编程序（而不是映射器），如

• 三位一体
• SoapDeNovo
• 绿洲....

Answer 3

Tophat可以处理搁浅的库和非搁浅的库。在快照中，中心区域确实具有+和 - 链读取。两端的偏差可能是您的文库制备或分析方法的一些特征。这个基因的方向是什么？看起来有点偏向左侧。如果左侧对应于3'末端，那么您的文库制备可能具有3'偏向特征（例如dT引发的反向转录）您分割RNA的方式也可能对您的读取分布产生影响。 我想我们需要更多信息才能找到真相。但我们也应该记住，tophat / cufflinks也可能有bug。